RT(Reverse transcription)란 무엇인가
RT는 Reverse transcription으로, RNA로부터 cDNA를 만들어내는 과정을 말합니다. 우리가 COVID-19의 PCR 검사를 수행한다고 하는 것들도 RNA virus이기 때문에 RT-PCR로 증폭해서 확인하는 검사방법이 되는 것입니다. 자세한 추가 내용은 아래 글에서도 확인해 보세요.
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RT-PCR이란 어떤 기술인가
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RT(Reverse transcription)의 준비물
- MMLV or AMV RTase
- RTase reaction buffer
- dNTP
- Oligo(dT) or Random primer(hexamer)
- RNA sample
RT(Reverse transcription) 실전 실험 방법
- RNA를 정량하여 2ug이 되도록 넣어주고 RNase free water를 11ul volume까지 채워줍니다.
- Oligo(dT)나 Random primer를 1ul 첨가하고 sample을 65℃에서 10min간 annealing 합니다.
- Sample mixture를 아래 표와 같이 제작합니다.
- 잘 섞어준 다음 37-42℃에서 10-50min간 RT반응을 진행합니다. (RT 조건에 따라 다름)
| RT mixture 제작 | |
| Primer annealing한 sample | 12ul |
| dNTP (2.5mM each) | 4ul |
| RTase | 1ul |
| 5x RTase buffer | 5ul |
| DW | 3ul |
| Total | 25ul |
RT(Reverse transcription) 참고사항들
- 너무 긴 RT 반응은 cDNA 합성이 오히려 저해될 수 있습니다.
- MMLV, AMV 중 어떤 RTase 사용하는지에 따라 적정 온도와 시간 조건이 달라집니다. (가장 정확한 프로토콜은 사용하는 RTase 제조사에서 제공하는 방법을 따르는 것이 중요함)
- Random primer를 사용하는지 Oligo(dT)를 사용하는지에 따라 RT 조건들이 달라집니다.
- RT가 끝난 cDNA는 냉동 보관하여 비교적 장기간 사용 가능합니다.
- 남은 RNA는 에탄올 보관 방법으로 deep freezer에서 보관하면 좋습니다.
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