Western blot을 위한 SDS-PAGE

Western blot의 대략적인 설명은 이전 포스팅에서 확인할 수 있습니다. Western blot을 좀 더 세분화하여 SDS-PAGE부터 보다 상세하게 설명해 보고자 합니다. 

 

Western Blot 웨스턴블랏의 기본 원리

SDS-PAGE란?

단백질의 전기영동에 사용되는 SDS-PAGE는 SDS를 넣어 수행하는 PAGE 실험법입니다. PAGE는 Polyacrylamide gel electrophoresis의 약자로, 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 정도로 번역이 가능합니다. PAGE 실험법이 단백질 전기영동에만 사용되는 것은 아니고 DNA의 전기영동에도 활용할 수는 있습니다. 다만 거의 통상 DNA는 Agarose gel에 간편하게 확인하는편이고 PAGE는 주로 단백질 확인용으로 사용합니다.

SDS를 넣는 이유

SDS를 넣지 않고 PAGE만 수행하면 단백질의 native 상태를 확인할 수 있습니다. SDS를 넣어주면 단백질의 disulfide bond를 끊어주고 전체 단백질을 음전하로 감싸서 오로지 전기영동시 단백질 자체의 size에 따라서 gel 상에서 전개되도록 만들어주는 역할을 합니다. 

Acrylamide gel의 그물구조

Polyacrylamide gel은 그물구조입니다. 그래서 단백질이 크기가 작으면 이 틈 사이를 잘 빠져나가 멀리 이동하고, 단백질 크기가 크면 얼마 이동하지 못하는 원리입니다. 주로 사용하는 acrylamide 용액은 30%짜리 stock을 사용합니다. Acrylamide : Bisacrylamide(N,N'-methylenebisacrylamide)가 29:1 정도의 비율로 된 것을 사용합니다. 다른 비율과 다른 농도의 stock도 있어 실험자에 따라 다른 농도의 시약을 사용하기도 합니다.

 

Acrylamide는 monomer구조인데 Bisacrylamide가 첨가되면 crosslinking이 되어 서로 연결이 됩니다. 여기에 APS(Ammonium persulfate)와 촉매제인 TEMED가 함께 더해지면 acrylamide가 연속적인 그물구조를 형성하게 됩니다. 그래서 이름에 Poly 가 붙어 polyacrylamide gel이 됩니다.

SDS-PAGE gel은 2층으로 제작

SDS-PAGE gel은 지면과 수직으로 세워 제작하는데 아래에는 Resolving gel을 굳히고 위에는 Stacking gel을 굳혀서 2층으로 제작합니다. 먼저 아래층 resolving gel부터 먼저 굳혀주는 방식으로 제작합니다. Resolving gel과 stacking gel은 서로 기본 조성은 같으나 acrylamide의 농도와 pH가 다릅니다.

 

통상 Resolving gel은 acrylamide의 농도를 6-15% 내외로 목적에 따라 제작합니다. 6%로 갈수록 큰 사이즈의 단백질 검출에 용이하고, 15%로 갈수록 작은 사이즈의 단백질을 보기에 좋습니다. Stacking gel은 보통 4-5% 정도로 제작합니다. 

 

또다른 차이 pH는 pI값의 개념이 함께 동반되어야 하는데 이 부분에 대해서는 추후에 포스팅을 새로 준비해 볼까 합니다. 결론만 말씀드리자면 resolving gel은 pH가 8.8이고 stacking gel은 pH가 6.8로 제작됩니다.

 

SDS-PAGE 종료 후 염색

SDS-PAGE가 끝나면 Coomassie blue 등의 시약을 이용해서 염색을 해주게 됩니다. 여러 단백질이 ladder 형태로 gel 상에 위에서부터 아래까지 염색되는 것을 확인할 수 있습니다. 만약 정제한 단백질을 gel을 내려 staining하면 정제된 단백질의 size에서만 깔끔하게 염색된 band가 나와야 순도 높게 잘 정제된 것입니다. Ladder 형태로 나오는 것은 cell lysate등을 이용해서 진행했을 때 나오는 전형적인 패턴입니다.

 

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