Restriction enzyme에 대하여
클로닝을 진행하다보면 RE cut 내지는 RE digestion, 혹은 한국어로 '제한효소 처리' 라는 단계를 접하실 수 있습니다. 이 단계는 무엇이냐 하면 제한효소를 처리해서 특정 DNA 서열을 인지한다음 특이적인 모양으로 잘라내는 단계를 말합니다. 마치 가위로 DNA를 자르는데 가위 모양이 제한효소에 따라 생긴게 조금씩 차이가 있는 것이라고 생각하면 됩니다.
제한효소는 미생물로부터 유래됩니다. 발견된 미생물의 이름을 따서 제한효소의 이름을 붙여주게 됩니다. 예를 들어 EcoRI라는 효소의 이름을 살펴보면 Escherichia coli의 RY13이라는 strain에서 발견된 I (첫번째 효소)라는 의미입니다.
발음을 한글로 적어보자면 '이코알원' 이라고 부르시면 됩니다. '이코알아이'라고 착각해서 부르시면 안됩니다. 맨 마지막은 숫자입니다. 비슷한 제한효소로 EcoRV가 있습니다. 이코알원은 많이 익숙해져서 이코알아이라고 착각해서 부르는 사람이 거의 없지만 초보자들은 EcoRV 효소를 처음 만나면 많은 비율로 '이코알브이'라고 읽으시기도 합니다. 그러나 맨 마지막 문자를 숫자를 의미하므로 EcoRV의 정확한 발음은 '이코알파이브'입니다.
제한효소들은 또한 type으로 나눌 수 있는데, 우리가 클로닝 등의 실험에 주로 사용하는 제한효소들은 type II 제한효소라고 생각하시면 됩니다.
Restriction enzyme에 의해 잘리는 위치
제한효소에 의해 잘리는 위치는 효소에 따라 천차만별입니다. 각각이 고유한 서열을 인식하고 고유한 특성의 모양으로 DNA를 절단합니다. 잘리는 형태에 따라 Blunt end와 Sticky end로 잘린 단면을 나눌 수 있습니다. Blunt end는 단어 의미대로 뭉툭한 형태로 잘린 것을 의미합니다. 쉽게 다시 말하면 일자로 잘려서 어느 한 부분 튀어나온 것 없이 잘리는 것을 말합니다. Sticky end는 조금 다릅니다. 점착 말단이라고도 부르는데, 말 그대로 어느 한 쪽이 삐져나오게 잘려서 다른 어딘가 동일하게 잘린 DNA를 만나면 바로 맞붙을 수 있는 형태로 잘린 것을 말합니다.
제한효소들은 신기하게도 각각이 고유한 서열을 인지하는데 그 것이 우연히 같은 위치인 경우도 있습니다. 같은 서열을 인식하지만 자르는 형태는 서로 다른 경우도 존재합니다. 또다른 경우로는 서로 인지하는 부위는 다른데 잘린 단면이 서로 상보적인 서열이라서 각각 다른 효소로 절단한 단면이지만 서로 붙일 수 있는 형태도 존재합니다. 정리해서 전문용어로 다시 설명하자면 다음과 같습니다.
- Isoschizomer : 서로 다른 두 개의 제한효소가 같은 DNA 서열을 인지하고 같은 위치에서 자르는 경우
- Neoschizomer : 서로 다른 두 개의 제한효소가 같은 DNA 서열을 인지하지만 자르는 위치는 서로 다른 경우
- Isocaudomer : 서로 다른 두 개의 제한효소가 각기 다른 DNA 서열을 인지하고 자르지만, 잘리고 나서 보니 sticky end 형태가 같아 호환하여 붙일 수 있는 경우
Cloning 과정에서 주의할 점
제한효소를 처리해서 클로닝을 하는 과정에서 주의해야 할 점은 벡터의 MCS 부위에 존재하는 제한효소 사이트 중에서 어떤 것을 사용할지 잘 골라야 한다는 점입니다. 벡터의 MCS 부분은 multiple cloning site로 여러 제한효소가 인지할 수 있는 DNA 서열을 한군데 모아놓은 부분입니다. 이 부분에 우리의 유전자를 끼워넣는 작업을 할 것인데, 벡터의 MCS 속에 존재하는 인지부위 중 어느 제한효소를 사용할지 잘 골라야 합니다.
만약, 1개의 효소만을 이용해서 벡터를 자른 다음 클로닝을 한다고 가정해 보겠습니다. 이 경우 클로닝은 당연히 가능합니다. 그런데 문제는 1개의 효소만 이용해서 벡터를 자르고 나면 벡터의 양쪽이 같은 sticky end를 갖게 됩니다. 그러면 우리가 넣고자 하는 유전자가 정방향으로 들어가거나 거꾸로 들어갈 수도 있습니다. 그래서 통상 클로닝을 하고자 할 때에는 double digestion이라고 양쪽 말단을 서로 다른 제한효소로 처리하여 방향이 뒤집히는 일이 없도록 해주는 것이 일반적입니다.
또한 두개의 제한효소를 선택했다고 하더라도 한번 더 체크하고 넘어가야 하는 것이 있습니다. 바로 우리가 양 말단에 사용하기로 한 효소에 의해 우리가 넣고자 하는 유전자가 잘리는지 검증이 필요합니다. 만약 벡터에 클로닝 할 용도로 KpnI 효소와 XbaI 효소를 사용하려고 했는데, 우리가 넣고자 하는 유전자 내부 서열에서 KpnI 인지 서열이 존재한다면 어떻게 될까요? 클로닝 과정에서 혹은 클로닝 이후 다음 이용하는 단계에서 KpnI 제한효소를 사용하면 벡터와 유전자 사이도 한 번 잘리게 되고 유전자 내부에서도 한 번 잘리게 됩니다. 그러면 우리가 넣은 유전자를 온전히 살려내지 못하는 경우가 발생합니다. 그래서 제한효소를 고를 때에는 특별한 목적이 있지 않은 이상 유전자 내부에 사용하고자 하는 제한효소의 인지부위가 없는 것으로 골라야 두고두고 편하게 실험하실 수 있습니다.
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