RT-PCR의 정의
코로나 시대를 지나오면서 일반 사람들에게 PCR이라는 용어가 익숙해졌습니다. PCR이란 지난번 포스팅에서 소개해드린 것처럼 Polymerase chain reaction입니다. 그 원리는 DNA를 프라이머를 붙여서 polymerase 효소를 이용하여 cycle수의 제곱만큼 DNA를 증폭시키는 기술입니다. RT-PCR은 PCR에 해당하는 세부 기술이라고 생각할 수 있습니다. 여기에서 RT의 의미는 Reverse transcription을 의미합니다. 한국어로 번역하자면 '역전사'라고 할 수 있습니다. 이전 포스팅에서 Transcription에 대해 말씀드렸었는데, DNA로부터 RNA를 만들어내는 과정을 transcription이라고 합니다. 여기에 '거꾸로'라는 의미의 'Reverse'가 붙으면 거꾸로 전사한다는 뜻이 됩니다. 의미 그대로 생각해보자면 RNA로부터 DNA를 만들어낸다는 것을 이해할 수 있습니다.
RT-PCR의 원리
RT-PCR의 역전사 단계를 진행하려면 역시나 효소가 필요합니다. 이 때 사용되는 효소는 reverse transcriptase라는 효소입니다. 이 효소는 RNA virus등에서 발견되는 효소로 RNA로부터 DNA를 역으로 합성해내는 작용을 합니다. 그래서 우리가 코로나 검사로 PCR검사를 한다는 말도 엄밀히 말하면 RT-PCR을 하는 것입니다. mRNA를 주형으로 삼아 역으로 DNA를 합성해 내면 온전한 DNA가 만들어지지는 않습니다. 왜냐하면 mRNA는 intron이 제거된 splicing(이전 포스팅의 exon, intron 및 splicing에 대한 포스팅 참고)을 거친 단계이기 때문입니다. 그래서 이렇게 mRNA로부터 만들어진 DNA는 cDNA라고 부릅니다. RT-PCR의 기본 과정은 mRNA로부터 reverse transcriptase를 넣어 cDNA를 합성해내고, 그 다음부터는 cDNA의 일부분을 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트를 활용하여 PCR하는 과정을 그대로 거치면 됩니다. PCR의 기본 원리에 RT과정이 추가되어 PCR의 template가 cDNA가 된다는 점만 추가되는 개념입니다.
RT-PCR의 활용방법
그렇다면 RT-PCR을 어떻게 활용해야 하는지 알아보겠습니다. 보통 PCR을 cloning의 목적으로 원하는 유전자 사이즈 그대로를 증폭시키는 것이 주된 목적이었다면, RT-PCR의 목적은 조금 다릅니다. 보통은 target으로 잡고자하는 mRNA가 세포내에서 얼마나 발현되는지를 정량하는 목적으로 RT-PCR을 수행합니다. 그래서 cDNA를 타겟하는 프라이머 세트는 증폭되는 절편 크기가 100-200bp정도가 되도록 비교적 짧은 단편이 생성되도록 디자인합니다. 정량 비교가 목적이기 때문에 정확한 정량을 할 수 있는 방법이 필요합니다. PCR의 기본 원리편에서 설명했던 것과 같이 PCR을 cloning등의 목적에서는 약 40-45cycle을 진행했는데, 이렇게 되면 plateau 상태에 이르게 됩니다. 플랫토라는 것은 더이상 증폭되지 못하고 증폭곡선이 평행하게 나타나는 구간을 말합니다. 이론적인 수학 계산이라면 cycle수의 제곱으로 계속해서 증폭이 되어야 하지만 polymerase의 활성 한계나 프라이머의 한계 등으로 더이상 증폭되지 못하는 단계를 의미합니다. 이정도 단계가 되면 모두다 최고치로 증폭이 되어버리기 때문에 정량 비교가 어렵습니다. 그래서 약 20-30cycle 내외에서 증폭정도를 비교해야 하는데 이를 보다 정확하게 비교하기 위해서는 실시간으로 형광을 달아 확인하는 것이 가장 좋은 해결방법입니다. 이 과정을 real-time PCR이라고 합니다. 공교롭게도 real-time도 약자로 RT이기 때문에 RT-PCR을 real-time으로 확인하고자 한다면 RT라는 단어가 겹치므로 보통 이때에는 real-time을 quantitative(정량)의 의미로 q라는 약자로 붙여주게 됩니다. 그래서 표기를 qRT-PCR이라고 하게 됩니다. 이 의미는 quantitative RT-PCR, 즉 mRNA로 RT-PCR을 할 것인데 real-time(실시간)으로 증폭 정도를 확인하는 실험이라고 해석할 수 있습니다. 형광을 나타내는 물질은 크게 2가지를 주로 사용합니다.
- SYBR green
- TaqMan
위 두가지 형광 detection 방법과 원리에 대해서는 다음 포스팅에서 좀 더 자세하게 알아보도록 하겠습니다.
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