Transformation이 필요한 이유
클로닝을 수행하는 과정에서 Plasmid DNA를 E.coli(대장균)에 넣어서 증폭하는 과정이 필수적입니다. 이 과정을 Transformation이라고 부르는데, 한국어로 번역하면 '형질전환'이라는 단어로 사용이 가능합니다. Transformation 과정이 왜 필요한지, 그리고 어떠한 방법으로 transformation을 수행하는지 알아보겠습니다.
- Transformation이 필요한 이유
- Transformation의 방법
- 배지의 조성
Transformation은 위에서 cloning과정 중 E.coli에 넣어 증폭을 하기에 필요한 필수 과정이라고 간단하게 말씀드렸습니다. 이러한 목적 뿐만 아니라 E.coli에서 재조합 단백질을 발현시키고자 할 때에도 사용되는 과정입니다. 정리해보자면 Transformation은 외부에서 우리가 넣어주는 Plasmid를 이용하여 E.coli의 system을 통해 무언가를 해내고자 할 때 사용한다고 생각하시면 됩니다.
Plasmid DNA를 증폭시키고자 한다면 PCR로 증폭시키기에는 한계가 있습니다. Plasmid는 원형의 모양으로 PCR을 통해 만들어지는 linear한 형태의 DNA 증폭은 다음 실험에 사용하기 어렵습니다. 또한 PCR로 증폭할 수 있는 DNA size의 한계가 있는데, Plasmid는 backbone에 사용되는 vector만 하더라도 그 크기가 5kb내외로 큰 편입니다. 그래서 Plasmid를 불려서 사용하기 위해서는 plasmid를 E.coli에 transformation해서 넣고 E.coli의 빠른 성장 system을 이용하게되면 하루만 키워도 엄청난 양으로 불릴 수 있습니다.
또 다른 목적인 재조합 단백질의 생산 측면도 E.coli의 system을 활용하는 것입니다. E.coli가 단백질을 만들어내는 system을 이용해서 Plasmid DNA로부터 단백질을 합성해내면 체내에 존재하는 단백질보다 많은 양의 단백질을 얻어낼 수 있고, 또는 체내에 존재하는 단백질을 일부 modification하여 mutation된 단백질들도 만들어낼 수 있습니다. 다만 E.coli에서 예를 들어 사람과 같이 고등 동물에서 발현되는 단백질을 만들어내겠다 할 때에는 100% 가능한 것은 아닙니다. 왜냐하면 E.coli가 갖고 있는 system만 가지고는 사람의 단백질을 완벽하게 만들어낼 수 없기 때문입니다. 불가능하게 만드는 대표적인 예가 Glycosylation과 같은 과정입니다. E.coli는 Glycosylation과 같이 translation 이후 단계의 어떠한 단백질의 modification 과정을 수행하지 못합니다.
그러나, 이러한 단점들이 존재함에도 불구하고 E.coli system과 transformation이 아직도 빈번하게 사용되는 이유는 조작의 간편성과 경제성에 있습니다. E.coli는 배양하는 과정에서 비용이 상당히 저렴합니다. 물론 이미 연구실 생활을 해 보신 분은 아시겠지만 이 분야 시약, 재료들의 가격이 전반적으로 비싼 편이라 절대적으로 저렴하다고는 할 수 없지만 mammalian cell을 이용한 재조합 단백질의 생산 같은 측면과 비교하면 엄청나게 저렴한 편입니다. 그리고 E.coli는 오염에 대한 문제만 조심하면 키우는 과정이 그리 어렵지 않습니다. 동물세포에 비해 키우는 장치 설비도 간단합니다. 그래서 아직까지도 학계와 산업 현장에서도 E.coli를 많이 사용하고 있습니다.
Transformation의 방법
Transformation에 사용하는 E.coli는 또 여러개의 strain이 존재합니다. 어떠한 목적으로 사용하는지에 따라 서로 다른 E.coli strain을 사용해야 합니다. 예를 들어 Plasmid를 불려서 사용하고자 한다면 보통 DH5 alpha와 같은 E.coli strain을 사용하게 됩니다. 반면 재조합 단백질을 만들어내고자 한다면 BL21(DE3)와 같은 strain을 사용합니다. 이는 목적에 따라 또는 참고하는 프로토콜에 따라 달라지므로 각 E.coli strain의 특징을 알고 계시는 것이 좋습니다. 그런데 보통은 위 설명드린 두가지에서 크게 벗어나지 않습니다.
이러한 E.coli strain이 정해지면 E.coli를 그대로 사용하는 것이 아니라 외부 Plasmid를 잘 받아들일 수 있는 상태로 제작된 Competent cell (CP cell)이라는 형태로 된 E.coli를 사용하게 됩니다. 만약 Heat shock 방법으로 Transformation을 수행하고자 한다면 Calcium chloride 등으로 처리한 CP cell을 이용하게 됩니다. 가장 간편한 방법이므로 보통의 transformation 단계에서는 heat shock 방법을 사용합니다. Heat shock이라는 의미 그대로 열 충격을 주어 plasmid가 E.coli CP cell 안으로 들어가도록 만드는 과정입니다. Heat shock은 CP cell에 Plamid DNA를 넣고 Ice 상태에서 incubation을 잠시 해준 다음 42도씨 온도에서 1분 30초간 열을 가해주는 방법입니다. 1분 30초의 heat shock이 끝나면 바로 ice에 넣어 차갑게 식혀줍니다. 고전적인 방법에서는 이 다음 Fresh한 LB media를 조금 넣고 30min - 1hr 정도 37도씨에서 shaking incubation하는 안정화 과정을 거치게 됩니다. 그런데 요즘 commercial하게 판매하는 제품들은 이러한 추가 과정 없이도 transformation이 잘 되도록 개선되어 출시되고 있습니다. 심지어 heat shock도 필요없다고 하는 제품들도 보입니다.
보다 나은 transformation을 원한다면 eletroporator를 이용합니다. 이는 전기를 흘려주어 plasmid를 CP cell 내부로 넣어주는 과정입니다. Heat shock용 CP cell과는 다른 eletroporation 전용 CP cell을 써야합니다. 일반 CaCl2가 처리된 CP cell들을 쓰면 스파크가 튀는데 E.coli가 다 죽어버립니다. Electroporator 장비에 맞는 tip과 장치, 그리고 CP cell을 사용하는 것을 권장합니다.
Transformation이 끝나면 이는 고체 LB 배지에 spreading이라고 펴 바르는 과정을 거치게 됩니다. Spreading을 해서 고체 LB 배지에 잘 흡수되도록 해주어야 O/N(Over night, 통상 16시간)후 colony가 형성되게 됩니다. Colony를 확인하는 과정에서 주의할 점은, 여러분이 공부해서 알고 있는 Blue/white screening 등의 방법이 언제나 가능한 것은 아닙니다. 내가 넣어준 plasmid가 Blue/white screening 용이 아니라면 colony는 무조건 하얀색만 나옵니다. Blue/white screening은 다음번에 기회가 되면 상세하게 설명해 보도록 하겠습니다.
배지의 조성
Transformation을 해서 고체 LB배지에 넣거나 액체 LB 배지를 넣어 안정화 시키는 과정이 필요하다면 LB 배지의 조성을 알고 있어야 합니다. 액체 LB 배지는 1L 기준으로 10g의 NaCl과 10g의 tryptone 그리고 5g의 Yeast extract가 들어갑니다. 간혹 사용하는 항생제의 특성때문에 low salt 등으로 조성이 변경되는 경우도 있습니다. 대표적으로 Lennox LB 배지 등이 이에 해당합니다. Lennox LB 배지는 Zeocin과 같은 항생제를 위해 사용하는 LB배지로 1L에 NaCl이 일반 LB의 절반인 5g만 들어가게 됩니다. 고체 LB배지는 액체 LB배지와 같은 조성에 1가지 굳혀주는 Agar가 추가되면 됩니다. Agar는 1L기준으로 15g-20g 내외로 넣어줍니다. 넣어주는 정도에 따라 gel의 굳기가 달라지는데, 정답은 없으니 소속된 연구실에서 따르는 프로토콜에 따라 제작하시면 됩니다.
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