Western Blot 웨스턴블랏의 기본 원리

Western blot의 기원

생물학 분야를 연구하는데에 있어서 가장 많이 활용되는 실험기법 중 하나인 Western Blot에 대해 알아보는 시간을 갖겠습니다. 이전 포스팅에서 Transfection에 대한 이야기를 했었는데, Transfection을 수행한 이후 단계에서 plasmid가 잘 들어가서 안에서 타겟하는 단백질이 만들어지고 있는지를 확인하는 방법으로도 사용하는 실험 기법입니다. 오늘은 아래의 순서로 Western blot에 대해 알아보겠습니다.

• Western blot의 기원
• Western blot의 원리 및 실험방법

Western blot을 위한 SDS-PAGE

Western blot이라고 처음 이름을 들으면 무엇을 의미하는지 이해하기 어렵습니다. Blot이라는 단어가 일상에서 많이 활용되지도 않아 잘 모르겠고 그것이 생물학에서 어떤 의미를 갖는지도 처음이면 파악하기가 어렵습니다. 만약 Blot, blotting 등에 대해 접해봐서 대략적으로 어떤 개념인지 파악이 되더라도 Western이 주는 의미는 무엇인지 단번에 알기 어렵습니다. Western blot 이름의 유래는 DNA를 검출하는 방법인 Southern blot으로부터 시작됩니다. Southern blot은 그럼 또 무슨의미인가? 남쪽 방향과 DNA가 도대체 무슨 상관일까? 생각이 들 것입니다. 그런데 Southern blot의 southern은 남쪽을 의미하는 것이 아니고 발명자의 이름에서 온 것입니다. DNA에 Probe를 사용해서 blotting하여 검출하는 법을 처음 개발한 사람이 Edwin Southern입니다. 그래서 이 사람은 자신의 이름을 붙여서 Southern blot 이라고 명명한 것입니다. 이후 비슷한 원리로 다른 연구자들이 RNA를 탐침하여 검출하는 blotting 기법을 고안해 내었습니다. 이 때 연구자들은 Southern이 있으니까 Northern으로 명명하게 됩니다. 일종의 언어유희, 말장난이었는데 RNA 탐침법은 그렇게 Northern blot이 됩니다. 그렇게 단백질의 검출법이 개발되자 'Southern과 Northern이 있으니 Western으로 가야겠다' 라며 오늘날의 Western blot이라는 이름이 된 것입니다. 요즘은 Google 번역기의 성능이 매우 좋아져서 Western blot을 번역하면 '웨스턴블랏' 이라고 번역이 됩니다. 초창기만 하더라도 Western blot을 번역하면 서양 얼룩 정도의 엉터리로 번역되는 해프닝도 있었습니다.

Western blot의 원리 및 실험방법

Western blot은 종합해서 원리를 말해보자면, 내가 원하는 단백질을 Gel을 내려 membrane에 옮긴 다음 antibody를 이용해서 검출해내는 방법이라고 할 수 있습니다. 그렇기 때문에 Western blot은 크게 2단계로 분리해서 생각해 볼 수 있습니다. (1) SDS-PAGE과정 그리고 (2)Antibody를 이용한 detection 과정으로 생각해 볼 수 있습니다.

(1) SDS-PAGE과정
먼저 원하는 단백질을 gel을 내려서 전개시켜 주어야 합니다. 이 때의 실험법을 SDS-PAGE라고 부릅니다. SDS는 SDS-PAGE를 수행할 때 넣어주는 시약입니다. SDS의 용도는 각 단백질은 아미노산 잔기에 따라 전하를 띠는 정도가 달라 전기영동시에 단백질 크기만을 기준으로 전개시키기가 어려워집니다. 그래서 순수하게 단백질의 크기에 따라 gel상에 전개시켜 놓기 위한 방법으로 SDS가 단백질을 감싸서 일정하게 음전하를 나타내도록 해주는 역할을 합니다. PAGE라는 것은 Polyacrylamide gel electrophoresis의 약자인데, 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동이라고 번역된다. Acrylamide를 이용해서 poly 형태로 만든 gel을 이용하여 전기영동한다는 의미입니다. Acrylamide gel은 bis-acrylamide와 함께 APS(Ammonium persulfate)와 촉매제인 TEMED까지 섞여지면 연속적인 그물구조를 형성하게 됩니다. 그래서 이러한 조성으로 굳혀서 사용하는 gel을 'poly-' Acrylamide gel이라고 부릅니다. SDS-PAGE running buffer의 기본 조성은 Tris-Cl과 Glycine으로 이루어져 있습니다. Gel상에서 Glycine이 나타내는 음전하와 SDS로 감싸진 단백질이 나타내는 음전하, 그리고 Cl- 이온이 나타내는 음전하들이 서로 속도경쟁을 하면서 (+)극 방향으로 흘려주는 전류를 따라 단백질 크기대로 gel상에 전개되는 원리로 진행됩니다.

(2)Antibody를 이용한 Detection 과정
만약 SDS-PAGE를 수행한 이후 gel 상에서 단백질들의 양을 종합적으로 확인하고자 할 경우에는 gel 자체를 꺼내어 coomassie staining을 해서 확인하기도 합니다. 그런데 Western blot 단계에서는 이 gel 위에 membrane을 얹어주고 전류를 흘려 단백질을 gel에서부터 membrane으로 옮겨주는 작업을 하게 됩니다. 이 과정을 transfer라고 부릅니다. Transfer가 끝나면 gel은 버리고 membrane 위에서 antibody를 이용하여 단백질을 검출하는 작업을 하게 됩니다. Antibody를 붙여주기 전에 먼저 blocking이라는 작업이 필요합니다. Blocking은 antibody가 다른 비특이적인 곳에 붙는 것을 방지해주는 사전 작업이라고 생각하시면 쉽습니다. Blocking이 끝난 membrane에는 primary antibody라고하는 1차 항체를 붙여주게 됩니다. 1차 항체는 내가 보고자하는 특정 단백질에 대한 항체입니다. 통상 동물에 특정 단백질을 주입하여 이를 방어하기 위해 생성된 항체를 추출해서 사용하게 됩니다. 최근에는 재조합 항체들의 기술도 상당부분 개발되어 있어 동물을 이용하지 않고 Phage display 방식을 이용한 재조합 항체를 이용하기도 합니다. 1차 항체는 설명한대로 그것이 만들어진 종(species)이 있습니다. 그래서 secondary antibody (2차 항체)는 해당 종의 IgG와 같은 것을 detection할 수 있는 항체를 사용합니다. 쉽게 다시 설명하자면 내가 보고자 하는 X라는 단백질을 WB으로 검출하고자 할 때, 1차 항체는 X라는 단백질을 잡을 수 있는 Anti-X를 Mouse로부터 생산해서 사용합니다. 그다음 2차 항체는 Mouse IgG를 잡을 수 있는 항체를 이용하면 결국 X단백질 - AntiX항체(mouse유래) - Anti-Mouse IgG의 형태로 결합하게 됩니다. 2차 항체의 끝부분에는 목적에 따라 여러 conjugation이 존재합니다. Western blot의 목적이라면 통상 HRP라는 Horseradish Peroxidase라는 효소가 달린 항체를 이용합니다. HRP는 ECL이라는 물질을 만나게 되면 빛을 나타내게 됩니다. 이것을 전통적인 방법에서는 X-ray film에 노출시켜 필름이 타버리는 위치를 확인하여 단백질 크기를 검출하는 방식으로 진행됩니다. 최근에는 Chemi-doc이라는 카메라가 달린 장비로 detection하여 이미지화 해서 바로 보여주는 기술이 사용됩니다.