사용할 시약은?
이전 포스팅에서 Transfection의 원리와 방법에 대해 간단히 설명을 하였습니다. 오늘은 실제 transfection을 lipofectamine 2000 시약을 이용해서 어떻게 진행하는지 실전 방법을 설명해 드리고자 합니다. Reagent를 이용한 transfection에는 여러가지 시약들이 출시되어 있는데, 가장 보편적으로 널리 사용되어 왔고 지금도 가장 많이 사용하고 있는 lipofectamine으로 실험 방법을 설명해 보고자 합니다. Lipofectamine은 invitrogen 브랜드 제품입니다. 93년도에 출시된 시약으로 30년 가까이 여러 논문들을 통해 충분히 검증되어 온 믿을만한 시약입니다. 단점이라고는 비싼 가격 밖에 없다고 봐도 될 정도로 성능면에서는 아주 좋습니다.
Transfection 방법
예전 lipofectamine 제품은 다소 번거로움이 있었습니다. Serum free media로 cell 배양 배지를 바꿔주고 transfection을 수행하고 4-5hr 정도 후에는 다시 culture해주던 media로 바꿔 주었어야 했습니다. 또한 lipofectamine만으로는 효율이 다소 떨어질 수 있어 Plus reagent라는 시약을 함께 넣어주었습니다. 그런데 Lipofectamine 2000 시약 이후로는 이러한 번거로움이 사라졌습니다. 업그레이드 된 시약의 장점은 다음과 같습니다.
- DNA와 Lipofectamine2000 complex를 만들어주는 초기 incubation 동안만 serum free media에서 반응시킬 것
- 반응한 complex는 그대로 cell seeding해 놓은 dish나 plate에 그냥 뿌려주면 됨
- Transfection 이후 complex를 제거 해주거나 culture media를 갈아주거나 더해주는 작업이 불필요함
실험 방법은 아주 간단합니다. 우선 Transfection 목적에 따라 cell이 seeding 되어 있어야 합니다. 보통은 O/N(16시간) 정도 후 발현 확인을 진행하면 충분히 단백질 발현이 확인됩니다. 그런데 만약 실험 조건에 따라 2-3일 정도의 배양이 필요한 경우도 있습니다. 이러한 경우 cell seeding시 cell의 양을 조절해서 seeding 하시기를 추천드립니다. 일반적으로 transfection 후 O/N incubation하여 실험을 진행하고자 하신다면 약 70-90%정도 confluent로 cell을 seeding해서 준비합니다.
6 well plate 스케일로 설명을 드려보겠습니다. 6 well plate에 적정량의 cell이 준비되어 있다면 클린벤치 안에서 1.5ml tube 2개를 준비해서 serum free media 200ul씩을 넣어줍니다. 그 다음 한 tube에는 DNA를 넣어주고 다른 tube에는 lipo 2000 시약을 넣어줍니다. DNA의 적정량은 6 well 기준으로는 약 2-3ug정도가 최대치입니다. 목적하는 바에 따라 DNA 양을 조절하시면 됩니다. Lipo 2000은 일반적인 경우 6 well 기준으로 3-5ul만 넣어도 충분히 transfection이 잘 됩니다. 준비가 다 되었다면 두 tube 속 용액을 섞어주고 5분간 RT(room temperature)에서 incubation해 줍니다. Incubation이 끝나면 cell이 seeding되어있는 plate well에 방울 방울 떨어뜨려주고 O/N incubation을 진행하시면 됩니다.
기타 주의할 점
위 실험 방법을 설명드리면서 계속해서 '일반적인 경우' 내지는 '보통은' 이라는 말을 사용한 것은 실험 조건(사용하는 cell, DNA의 quality, 배양 배지 등)에 따라 transfection 효율이 차이가 많이 나기 때문입니다. 위에서 보통의 조건이라고 표기한 것들은 예를 들어 293 cell과 같이 transfection이 용이한 '부착상태' 세포에 순도가 높고 재조합 단백질로의 발현이 어렵지 않은 plasmid를 기준으로 설명드렸습니다. 만약 내가 진행하는 실험이 까다로운 조건들이 있다면 꼭 시약의 농도별, DNA의 농도별 test를 진행하셔서 조건을 잡으시기 바랍니다.
추가적으로, 세포의 경우 부착상태 세포가 transfection 효율이 훨씬 좋습니다. Suspension culture 세포로 진행하고자 하시는 경우 lipo 2000 시약을 최소 2배 이상 넣어서 test를 진행하시는 것을 추천드립니다.
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