PCR의 기본 개념
DNA를 증폭시킬 수 있는 PCR 기술에 대해 알아보겠습니다. PCR이라는 단어는 관련 학과 전공을 하고 있는 학생이나, 진학 희망 학생들 또는 고등학교 이과 수업을 들은 학생들 정도만 사용하는 용어였습니다. 그런데 코로나 시대를 지나오면서 PCR 검사방법이 도입되어 PCR이라는 용어가 일반적으로 널리 사용되기 시작하였습니다. 그럼 PCR이 정확하게 어떤 방법이기에 코로나 검사를 할 수 있는 것인지 그 기본 개념과 원리를 이번 글에서 살펴보도록 하겠습니다.
- PCR의 기본 개념
- PCR의 단계별 과정
- Cycle수와 증폭의 상관성
PCR 단어 역시 영어로 된 약자입니다. Polymerase chain reaction의 약자로 한국어로 풀어보면 중합효소 연쇄반응이라고 할 수 있습니다. 접미사 '-ase'가 붙으면 어떠한 효소 활성 등을 나타내는 것을 의미한다고 생각하면 됩니다. 그래서 'poly'는 많다 'mer'는 어떠한 단위나 부분을 의미합니다. 그래서 Polymer의 뜻은 여러개가 붙어 이루는 단위 정도로 생각하면 됩니다. 여기에 -ase가 붙어 polymerase가 되면 polymer를 합성해내는 효소의 의미로 생각하시면 됩니다. 이는 중합효소라고 한국어로 번역됩니다. Polymerase에 의해 polymer가 계속해서 합성되어가는 'Polymerization'과정을 PCR이라고 볼 수 있는 것입니다.
그렇다면 중합효소는 정확하게 어떤것이 사용될까 궁금하실 것입니다. PCR에서 사용하는 polymerase는 대표적으로 Taq과 Pfu가 있습니다. 잠시 다른이야기를 먼저 해보자면, Taq과 Pfu와 같은 명명법은 생물학에서 자주 사용되는 명명법인데요, 해당 효소를 발견한 종의 학명으로부터 이름을 붙여주게 됩니다. Taq은 Thermus aquaticus라는 미생물로 부터 유래된 것으로 T와 aq를 따왔고, Pfu는 Pyrococcus furiosus에서 P와 fu를 따와서 지어진 이름입니다. 다시 본론으로 돌아와서 Taq이나 Pfu polymerase 들은 높은 온도에서 생존하는 미생물들로 부터 얻어낸 polymerase입니다. 그래서 PCR에서 사용될 수 있는 것입니다. 왜 높은 온도에서 버티는 polymerase가 필요한지는 아래 PCR의 단계별 과정에서 세부적으로 설명 하도록 하겠습니다.
PCR의 단계별 과정
(1) DNA denaturation
PCR의 첫단계는 이중나선으로 이루어진 DNA를 한가닥으로 풀어주는 denaturation 과정입니다. 이 과정은 높은 온도 (약 95도 내외) 조건에서 진행되는데, PCR의 반응시 필요한 재료들을 한번에 넣어주어야 하기 때문에 단백질인 polymerase 효소들은 변성이 오기 쉬운 조건이 됩니다. 그렇기 때문에 고온에서 생존하는 미생물로부터 얻은 Taq이나 Pfu polymerase를 사용해야만 PCR의 첫 단계인 denaturation 단계에서 효소 활성을 잃지 않고 PCR 반응을 끝마칠 수 있습니다.
(2) Primer annealing
DNA denaturation이 되고 나면 단일가닥으로 만들어진 DNA에 Primer라는 복제 시작점과 같은 짧은 oligo 가닥을 붙여주게 됩니다. Primer는 증폭하고자 하는 DNA의 시작과 끝을 기준으로 1쌍으로 만들어 사용합니다. 원하는 시작점 DNA에 상보적인 결합을 하도록 18-20mer(18-20개의 A,G,C,T로 이루어진 짧은 nucleotide 단편 조각을 의미)의 primer를 제작하고, 증폭을 마치고자 하는 위치에도 마찬가지로 상보적인 primer를 제작하여 줍니다. 이를 방향으로 나타내어 Forward, Reverse primer라고 간단하게 부르기도 하고, Sense/Anti-sense primer라고 부르기도 합니다. Primer가 분리된 DNA에 붙게 되면 다음 단계로 넘어가서 다음 반응이 일어납니다.
(3) Extension
Primer가 붙은 다음 이제 그 부분을 시작으로 polymerase가 작용하여 새로운 DNA를 만들어내게 됩니다. 이 때 재료로는 PCR반응에 처음에 같이 넣어준 dNTP가 사용됩니다. dNTP는 dATP, dGTP, dCTP, dTTP를 의미합니다. DNA의 구성 염기인 A,G,C,T의 TP(Triphosphate)형태를 의미합니다. 인산기가 3개 붙어있는 형태입니다. 이렇게 해서 Extension이 일어나면 DNA가 primer로 설정해 놓은 만큼 처음 넣어준 DNA 주형(template)를 따라 만들어 집니다. 이론적으로 계산하면 1개의 DNA를 처음 넣으면 이것이 2가닥으로 나눠지고 각 가닥은 Primer와 polymerase, dNTP에 의해 다시 이중가닥 DNA로 채워지면서 2개의 DNA로 x2가 되는 과정입니다.
Cycle수와 증폭의 상관성
위에서 PCR의 단계별 과정을 알아보았습니다. (1)DNA denaturation (2)Primer annealing (3)Extension의 과정을 거쳐 DNA는 x2로 증폭되는 것을 이해하였습니다. 이 과정을 PCR 1cycle이라고 부릅니다. 이론적으로 1cycle때 x2가 되면 2cycle째에는 template DNA가 2개로 시작됩니다. 2cycle때에는 2개의 DNA가 x2가 되므로 4개가 만들어집니다. 3번째 cycle은 4개로 시작한 DNA가 x2가 되므로 8개가 됩니다. 이렇게 PCR은 2의 n제곱으로 증폭이 되는 이론입니다. 통상 cloning 등을 위한 PCR은 40-45cycle까지도 수행하니 처음에 ng단위의 적은 DNA만 넣어주어도 이론상 2의 45제곱개의 DNA로 증폭이 될 수 있는 획기적인 실험 방법이 바로 PCR입니다. 그래서 우리가 코로나 검사를 할 때 PCR로 증폭을 하면 몸속에 있는 적은 바이러스도 검출이 가능하게 되는 것입니다. 엄밀히 말해서 코로나 바이러스의 PCR은 RT-PCR입니다. 이 부분은 다음에 RNA와 RT, 그리고 RT-PCR에 대해 자세히 설명하는 시간을 갖도록 하겠습니다.
댓글