DNA elution의 방법과 원리
DNA elution kit가 spin column 방식이라면 column 중간 부분에 하얀색 membrane이 들어있는 것을 볼 수 있습니다. 이 부분은 silica로 High salt 조건에서 bridge를 형성합니다. 보통 NaI solution 하에서 이러한 반응이 일어나는데, 그렇게 되면 Silica-Na+의 구조를 형성합니다. Na+가 노출되어 있으면서 silica에 붙어있는 형태로, Na+와 DNA의 Phosphate (-) charge가 결합하여 결국 silica에 DNA가 붙잡혀 있는 형태가 됩니다. Washing 과정 후 DW나 Tris-EDTA 등의 buffer를 흘려주면 low salt solution이기 때문에 silica-Na+ bridge가 끊어지게 되고 DNA가 떨어져 나오게 되는 원리입니다.
DNA gel elution 과정은 어떠한 형태의 kit를 사용하든지 처음 Gel 상태에서 원하는 size의 DNA를 잘라내는 것으로 시작합니다. DNA를 전기영동하여 size 분리를 해서 우리가 얻어내고자 하는 위치의 DNA를 칼로 오려냅니다. 그 다음 1.5ml tube를 하나 꺼내어 0점을 잡고 DNA gel 조각을 넣어 다시 무게를 측정합니다. 이 때 측정된 무게의 3배에 해당하는 volume으로 NaI solution을 넣어주게 됩니다. 그리고 약 55-60도 정도의 온도에서 10min 정도 incubation하면 gel이 다 녹아서 액체 상태가 됩니다. 이것을 kit 형태에 따라 spin column 방식이면 column에 장착하여 흘려보내주고, Bead 부착 방식이면 bead를 넣어 DNA와 bead의 complex를 침전시켜 주면 됩니다. Wash 후 DW 등의 elution buffer로 (low salt buffer) elution 까지 하는 과정도 모두 동일합니다.
DNA elution은 언제 사용하는가
생명공학 실험을 진행하다보면 아주 잦은 빈도로 DNA elution을 진행하게 됩니다. 대부분은 Agarose gel 상에 전개된 DNA를 잘라내어 gel을 녹이고 DNA를 회수하는 방법으로 진행됩니다. 간혹 gel에 전개시키지 않고 그냥 elution을 진행하는 경우도 존재합니다. Elution은 통상 3가지 정도의 목적이 있기 때문에 진행하게 됩니다.
- 서로 다른 크기의 DNA가 섞여있을 때 원하는 크기의 DNA만 얻기 위하여
- 다음 실험을 위해 buffer가 바뀌어야 하는 경우
- DNA를 회수하면서 농축이 필요한 경우
그럼 3가지 목적들이 어떤 의미를 갖는지 상세하게 하나씩 알아보도록 하겠습니다.
1. 서로 다른 크기의 DNA가 섞여있을 때
보통 Cloning을 진행하는 과정에서 이 목적으로 DNA elution이 가장 많이 사용됩니다. 예를 들어 내가 cloning하고자 하는 gene이 pUC57이라는 vector에 들어있는 형태라고 가정해 보겠습니다. 그러면 우리는 원하는 insert만을 잘라내어야 합니다. 이 때 사용할 수 있는 방법은 2가지 정도가 가장 보편적인 방법이 되겠습니다. 첫 번째는 insert에 해당하는 부위만 증폭시킬 수 있게 primer set를 제작한다음 PCR을 떠서 insert만을 얻어내는 방법입니다. 두 번째는 적절한 restriction enzyme이 사용 가능한 상태라면 이것을 이용해서 insert와 vector를 서로 분리시켜내는 방법입니다. 두 방법 모두 진행한 다음 이후 단계를 위해서는 elution을 수행해야 합니다. 그런데 서로 다른 크기의 DNA가 섞여있을 때 원하는 크기의 DNA만 얻어내기 위해 elution하는 목적은 두 번째 상황에 해당합니다. 예를 들었던 pUC57 vector와 내가 원하는 gene이 restriction enzyme에 의해 잘리고 나면 액체 상태에 서로 섞여있기 때문에 이를 이용해서 바로 실험을 진행하지는 못합니다. 이 때 agarose gel을 내려서 size별로 DNA를 분리하면 vector와 insert가 각각의 size에 따라 gel 상에 다른 위치에 나타나게 됩니다. insert에 해당하는 위치의 band를 오려내어 DNA elution 단계를 진행하면 우리가 찾던 gene 만을 다시 얻어낼 수 있습니다.
2. 다음 실험을 위해 buffer가 바뀌어야 하는 경우
예를 들어 PCR product를 sticky end로 만들어주기 위해 restriction enzyme으로 digestion을 진행했다고 가정해 보겠습니다. 그러면 반응 용액 속에는 restriction enzyme digestion에 적합한 buffer 성분이 함유되어 있습니다. 이것을 이용해서 바로 다른 원하는 vector에 ligation을 바로 시키려면 ligation에 적합한 buffer가 필요한데, 이 때 restriction enzyme digestion에 사용한 buffer가 ligation에 방해가 될 수 있습니다. 그래서 다음 실험에 다른 목적으로 buffer가 바뀌어야 한다면 DNA elution 과정을 한 번 거쳐서 DNA를 순수한 상태로 다시 확보하는 것이 중요합니다.
3. DNA를 회수하면서 농축이 필요한 경우
DNA가 녹아있는 용액의 total volume이 너무 큰 나머지 DNA의 총량은 적당히 존재하는데 용액 속 농도가 낮은 경우가 가끔 있습니다. 이 때 만약 단계상에서 DNA elution이 진행된다면 DNA를 보다 쉽게 농축하는 좋은 기회로도 작용됩니다. 다른 목적에 의해 Elution을 진행한다고 하더라도 마지막 Elution buffer로 DNA를 회수하는 과정에서 buffer의 total volume을 조절하면 DNA의 용액 속 농도가 높아질 수 있습니다. 반대로 너무 높은 농도였다면 elution 과정에서 buffer를 보다 여유있게 넣어주면 놓도가 조금 희석되어 적정한 농도가 될 수 있습니다.
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